Explorando o uso de aptâmeros para tratar a acondroplasia

Introdução

Há muito tempo se sabe que há um grande número de proteínas (cadeias de moléculas feitas de aminoácidos) que são capazes de se ligar diretamente com regiões específicas do DNA (cadeias de moléculas feitas de nucleotídeos), quer para estimular o início de um processo de leitura de um gene (transcrição) quer para bloqueá-lo. Assim, deve ser facilmente imaginável que moléculas feitas de nucleotídeos também possam ser capazes de se conectar diretamente à proteínas.

Nos anos noventa, com este conceito em mente, os cientistas passaram a identificar um grande número de moléculas feitas de sequências de nucleotídeos de DNA ou RNA, que chamaram de aptâmeros (1,2). Não sei se você já leu o último artigo deste blog. Nele, tentei comparar a forma como pesquisadores buscam encontrar novas drogas com técnicas que parecem com um tipo de pesca ou de filtragem. Para aptâmeros, podemos usar o mesmo conceito, uma vez que a tecnologia atual usada para identificá-los, conhecida pela sigla SELEX (link em inglês), também usa um método de filtragem para selecionar as melhores moléculas candidatas.

Da mesma forma que aquelas proteínas capazes de se ligar direta e especificamente a algumas sequências-alvo de nucleotídeos do DNA no núcleo da célula, aptâmeros também são muito específicos em relação aos seus alvos. Você pode selecionar qualquer parte do alvo como isca para os aptâmeros. No caso de uma enzima receptora, tal como o nosso familiar receptor de fator de crescimento de fibroblastos do tipo 3 (FGFR3), esta isca pode ser a parte externa da enzima, ou de um segmento transmembrana ou os bolsos de ATP (figura) de que já falamos em artigos anteriores.

 

Esta propriedade particular, de ter um único e específico alvo, faz dos aptâmeros uma potencial estratégia para o tratamento de doenças ou condições em que a causa é uma proteína que não está funcionando corretamente. Você consegue imaginar isso? Vamos dar um exemplo de um aptâmero já em uso na clínica.

Um aptâmero em ação

A degeneração macular é uma condição que afeta os olhos das pessoas de mais idade e pode levar à cegueira. Um dos mecanismos que leva ao distúrbio é um excesso de proliferação vascular (criação de um número excessivo de novos vasos sanguíneos na retina). A produção de novos vasos é gerida pela ativação de um receptor na membrana celular das células presentes na retina chamado de receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) e, claro, a molécula que se liga a ele é um VEGF (também chamado de ligante).

Existem várias terapias disponíveis para o tratamento desta condição, com eficácia variável, mas uma é singular: o pegaptanib, o primeiro aptâmero a chegar à farmácia. Vendido como Macugen™, o pegaptanib é um aptâmero específico para o VEGF. Seu modo de ação é simples: ao se ligar ao VEGF, ele bloqueia a capacidade deste ligante de se conectar ao receptor (figura). Como o receptor não pode ser ativado, a produção de novos vasos sanguíneos não é estimulada e a condição não evolui no mesmo ritmo que faria se deixada sem tratamento.

Desde a descoberta dos aptâmeros, muitos têm sido desenvolvidos para vários fins terapêuticos e estão agora sendo explorados em estudos clínicos, na sua maior parte contra o câncer. O câncer é realmente um grande desafio e um enorme esforço tem sido feito a fim de encontrar novas terapias para vencê-lo. A pesquisa inclui alvos como os receptores de membrana celular, tais como o receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR), uma outra enzima localizada atravessada na membrana celular do mesmo modo que o FGFR3. O funcionamento excessivo do EGFR é frequentemente encontrado no câncer de mama (e em outros tipos também) e, hoje, algumas das terapias mais eficazes para o câncer de mama são dirigidas contra o EGFR.

Controlando a quantidade de sinais a partir da antena

Antes de continuarmos o nosso voo sobre os aptâmeros, será bom entender como a célula gerencia os muitos, muitos receptores ativos localizados na membrana celular. Isto será importante para pensar sobre o que podemos esperar acerca de uma das possíveis maneiras de como um aptâmero visando o FGFR3 poderia funcionar.

Como eu disse, existem centenas de diferentes receptores instalados através da membrana celular, todos funcionando como antenas químicas para ajudar a célula a reagir ao que está acontecendo no seu meio. Da resposta imune à apoptose, um número incrível de interações celulares guiadas por essas antenas já foram descritas.

No entanto, estas antenas não são permanentes. Como em qualquer processo biológico para manter a vida em equilíbrio, há um certo número de sistemas de controle que regulam o tempo de ação desses receptores. Quando uma enzima receptora, vamos dizer o FGFR3, é ativada por um ligante (um FGF), forma um complexo molecular que começa a transmitir sinais às suas cascatas químicas específicas (revisto aqui) e, a seguir, é atraída para o interior da célula. Então, este complexo é identificado por proteínas como a ubiquitina, que irá marcá-lo e conduzi-lo aos sistemas de degradação, onde as proteínas são desfeitas. Ao usar estes sistemas de controle, a célula é capaz de regular o tempo que um receptor pode conduzir sinais do exterior para o núcleo da célula. Você consegue ver para onde estamos indo?

Aptâmeros concebidos para se ligar EGFR2 (HERB2) fazem com que a sua degradação seja acelerada e reduzem o crescimento do câncer.

Em um estudo recente, pesquisadores identificaram um par de aptâmeros específicos para o EGFR2. O EGFR2 é uma das quatro enzimas receptoras da família EGFR e é um importante fator estimulante em algumas formas de câncer de mama e outros cânceres. O bloqueio ou desativação do EGFR2 causa redução do crescimento do tumor e reduz a taxa de recidiva em casos devidamente tratados. Neste estudo, Mahlknecht G et al. (3) realizaram vários testes com aptâmeros por eles identificados e descobriram que eles agiam forçando a degradação do receptor sem que ele tivesse sido ativado. Isto, por sua vez, resultou na inibição do crescimento do tumor nos modelos usados nos testes. Os aptâmeros testados não mostraram maiores problemas em termos de toxicidade, o que também é uma informação importante.

Em resumo, este estudo evidenciou que um aptâmero com um alvo localizado no exterior da célula é capaz de bloquear a sua função e causa o efeito previsto (aqui, a inibição do crescimento do tumor). A mesma estratégia pode ser aplicada para o FGFR3.

A estratégia de usar aptâmeros para acondroplasia pode ter vantagens:

• Aptâmeros são pequenas moléculas provavelmente capazes de transitar livres na placa de crescimento e de alcançar o condrócito;
• Aptâmeros são muito específicos, tornando baixo o risco de causar efeitos fora- do-alvo (quando um medicamento provoca efeitos indesejados ou inesperados devido à interação com um alvo não pretendido);
• Aptâmeros costumam ter um perfil de risco baixo de toxicidade.

No entanto, aptâmeros são um pouco frágeis e vítimas naturais do sistema enzimático do corpo. Eles precisam de proteção para alcançar os seus objetivos. Isto pode ser conseguido com o acoplamento de transportadores e disfarces, com um dos vários sistemas já disponíveis (analisamos isso aqui). Este obstáculo não é nada que não possa ser solucionado.

Concluindo

No final de 2012, em uma conversa com um especialista no desenvolvimento de medicamentos e de investimento de capital de risco, mencionei os aptâmeros como uma estratégia a ser explorada como uma terapia potencial para a acondroplasia, mas este especialista se mostrou cético sobre eles. Minha opinião é que não sabemos. Desde que aprendi sobre os aptâmeros tenho feito buscas em bancos de dados médicos, tais como o Pubmed e nunca encontrei um estudo testando aptâmeros contra o FGFR3. Aqui, o desafio é novamente encontrar um investigador com a mente aberta e com recursos adequados, para explorar a possibilidade de aptâmeros serem usados ​​para tratar a acondroplasia.

Referências

1. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990; 249 (4968): 505-10. 

2. Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 1990; 346(6287):818–22.

3. Mahlknecht G et al. Aptamer to ErbB-2/HER2 enhances degradation of the target and inhibits tumorigenic growth. PNAS 2013; 110 (20): 8170-8175.

Exploring the use of aptamers to treat achondroplasia

Introduction

For a long time we know that there are a multitude of proteins (molecule chains made of amino acids) which are capable to connect directly with distinct regions of the DNA (molecule chains made of nucleotides), either to stimulate the start of a gene reading process (transcription) or to block it. So, it should be readily conceivable that molecules made of nucleotides could also be capable to connect directly with proteins.

In the nineties, with this concept in mind, scientists started to identify a large number of molecules made of DNA or RNA nucleotide sequences, which they ended to name aptamers (1,2). I don’t know if you have already read the last article of this blog. There, I tried to compare the way researchers find new drugs with some kind of fishing or filtering technique. For aptamers, we can use the same concept, since the current technology used to identify them, known by the acronym SELEX, also uses a filtering method to select the best candidate molecules.

Like those proteins capable to bind directly and specifically some target nucleotide sequences of the DNA in the cell nucleus, aptamers are also very specific for their own targets. You could select any part of the target as bait for aptamers. In the case of a receptor enzyme such as our familiar fibroblast growth factor receptor type 3 (FGFR3), this bait could be the external part of the enzyme, or a transmembrane segment or the ATP pockets (figure) we have already reviewed about in previous articles.

This special property, to have a single, specific target, makes aptamers a potential strategy for the treatment of diseases or conditions where a protein is not working properly. Can you imagine that? Let’s give an example of an aptamer already in use in the clinic.

An aptamer in action

Macular degeneration is a condition that affects the eyes of aged people and can lead to blindness. One of the mechanisms thought to drive the disorder is an excess of vascular proliferation (creation of an excessive number of new blood vessels in the retina). The production of new vessels is managed by the activation of a receptor in the cell membrane of cells present in the retina called vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), and of course, the molecule which binds it is a VEGF (also called ligand).

There are several therapies available for the treatment of this condition, with variable efficiency, but one is unique: pegaptanib, the first aptamer to reach the pharmacy. Sold as Macugen™, pegaptanib is an aptamer specific for VEGF. Its mode of action is simple: binding VEGF, it blocks the ability of this ligand to connect to the receptor (figure). As the receptor cannot be activated, then new vessel production is not stimulated and the condition does not progress in the same pace it would if left untreated.

Since the discovery of the aptamers, many have been developed for therapeutic purposes and several are now being explored in clinical trials, mostly in cancer. Cancer is truly a huge challenge and a lot of effort has been given to find new therapies to beat it. This includes targets such as cell membrane receptors like the epithelial growth factor receptor (EGFR), another enzyme located across the cell membrane in the same way FGFR3 is. EGFR excessive functioning is often found in breast cancer (and in other kinds, too), and today some of the most effective therapies for breast cancer are directed against EGFRs.

Controlling the amount of signals from the antenna

Before we continue our flight over the aptamers, it will be good to understand how the cell manages the many, many active receptors located in the cell membrane. This will be important for us to understand what we could expect about one of the possible ways an aptamer targeting FGFR3 could work.

As I said, there are hundreds of different receptors installed across the cell membrane, all functioning like chemical antennas to help the cell respond to what is going on in the environment. From immune defense to apoptosis, an incredible number of cell interactions have already been described guided by those antennas.

However, these antennas are not permanent. As for any biological process to keep life on balance, there are a number of control systems that regulate the action span of these receptors. When a receptor enzyme such as FGFR3 is activated by a FGF it forms a molecule complex that starts to signal to its specific chemical cascades (reviewed here), and is attracted to the interior of the cell. 

Then, this complex is spotted by proteins such as ubiquitin, which will tag it and drive it to degradation systems, where the proteins are dismantled. By using these control systems, the cell is able to regulate for how long a receptor can conduct signals from abroad to the cell nucleus. Do you see where we are going?

Aptamers designed to bind EGFR2 (HERB2) causes its accelerated degradation and reduce cancer growth.

In a recent study, researchers have identified a couple of aptamers specific for EGFR2. EGFR2 is one of the four receptor enzymes of the EGFR family and is an important driver of some forms of breast and other cancers. Blocking or disabling EGFR2 causes impairment of tumor growth and reduces the recurring rate in appropriately treated cases. In this study, Mahlknecht G et al. (3) performed several tests with the aptamers they identified and found that they worked by forcing the receptor to degradation without being activated. This, in turn, resulted in inhibition of tumor growth in the models the researchers used. The aptamers tested did not show major concerns in terms of toxicity, which is also important information.

In summary, this study gives evidence that an aptamer having a target located outside the cell is able to block its function and causes the planned effect (here, tumor growth inhibition). The same strategy could be applied for FGFRs.

A strategy using aptamers for achondroplasia could have advantages:

• Aptamers are small molecules, probably free to transit in the growth plate and reach the chondrocyte;

• Aptamers are very specific, making low the risk of having off-target effects (when a drug causes effects due to interactions with a non-intended target);

• Aptamers use to have a low toxicity risk profile.

Nevertheless, aptamers are somewhat fragile and natural victims of the body enzymatic system. They need protection to reach their targets. This can be achieved by cloaking them with one of the several transport and delivery systems already available (we reviewed this here). This is nothing that cannot be overcome.

Concluding

In the end of 2012, in a conversation with an expert in drug development and venture capital investment, I mentioned the aptamers as a strategy to be explored as potential therapy for achondroplasia, but this expert was skeptical about them. My opinion is that we don’t know. Since I learned about aptamers I have been making random searches in medical databases such as Pubmed and never found a study testing an aptamer against FGFR3. Thus, here, the challenge is again to find an investigator with open mind, and with appropriate resources, to explore the possibility of aptamers being used to treat achondroplasia.

References

1. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990; 249 (4968): 505-10.

2. Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 1990; 346(6287):818–22.

3. Mahlknecht G et al. Aptamer to ErbB-2/HER2 enhances degradation of the target and inhibits tumorigenic growth. PNAS 2013; 110 (20): 8170-8175.