A última fortaleza: a cartilagem da placa de crescimento

A Medicina tem combatido eficientemente doenças causadas por proteínas alteradas que o corpo produz durante uma doença ou devido a uma mutação genética. Na verdade, os médicos têm em mãos um número significativo de fármacos biológicos (anticorpos) ou de origem sintética, que podem ser utilizados para bloquear estas proteínas para o tratamento de várias doenças como o câncer e doenças reumáticas. Assim, atualmente, doenças como o câncer de mama podem ser derrotadas com mais facilidade e uma mulher afetada tem mais chance de sobreviver após o diagnóstico se o tratamento correto é aplicado mais cedo. Você pode ler mais sobre um anticorpo contra uma proteína produzida pelas células de câncer de mama aqui.
A acondroplasia é causada por uma única substituição de um das centenas de aminoácidos que formam a cadeia da proteína, ou enzima, chamada de receptor do fator de crescimento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3). A troca de aminoácidos torna esta enzima mais ativa que o normal e, como o papel natural do FGFR3 é regular negativamente o ritmo de crescimento ósseo, o resultado é que as crianças que carregam a proteína alterada crescerão menos do que poderiam. As conseqüências médicas e pessoais são muito bem conhecidas.

Enzimas são proteínas capazes de causar ou acelerar as reações químicas no interior do corpo. Elas têm cargas elétricas distintas e caracteísticas que fazem delas bons alvos em termos da criação de compostos ou drogas que podem reagir com elas e bloquear as suas funções. O FGFR3 não é exceção. Na verdade, já existe uma lista expressiva de anticorpos e de moléculas sintéticas capazes de bloquear ou reduzir a atividade do FGFR3 (veja a tabela abaixo com uma lista parcial).
Lista de fármacos e anticorpos com ação contra o FGFR3.

Se já temos tantas ferramentas utilizáveis, o que está nos impedindo de facilmente tratar a acondroplasia? Porque não basta escolher um dos bons anticorpos disponíveis e dar à criança afetada? O FGFR3 seria bloqueado, o freio do carro não iria mais parar o carro e o crescimento seria resgatado. Parece muito bom, não é?

Esta não é uma estrada fácil

Eu sei, vou repetir um pouco o que escrevi em outros artigos mais antigos neste blog, mas não vamos perder nada revisitando este tópico. Pelo contrário, a idéia aqui não é apenas dar informações, mas compartilhar conhecimento. E com o conhecimento vem insight.

Existem várias razões biológicas e econômicas importantes para explicar porque é tão difícil encontrar bons tratamentos para a acondroplasia. Neste artigo sobre a placa de crescimento, estaremos olhando apenas os biológicos.

Claro que a placa de crescimento não é o único problema. Uma razão importante que torna difícil tratar a acondroplasia está relacionada à estrutura do FGFR3. O FGFR3 é uma de uma família de quatro enzimas receptoras e apresenta grande homologia (semelhança) com suas irmãs. Além disso, em relação a uma das partes reativas mais importantes da sua estrutura, que é chamada de bolsos de ATP (do inglês ATP pockets), a homologia é também significativa com as enzimas de outras famílias de receptores. Este padrão implica em que muitas das atuais drogas sintéticas capazes de bloquear o FGFR3 apresentam a mesma ação também nos outros FGFRs e em outras enzimas. Queremos bloquear apenas o FGFR3, pois poderia ser perigoso interferir em outras reações químicas do corpo. Portanto, é um enorme desafio desenvolver uma droga para bloquear somente o FGFR3.

Os anticorpos contra o FGFR3 são mais específicos. Vários foram criados e um já está sendo testado para alguns tipos de câncer em que o FGFR3 desempenha um papel importante para estimular a progressão da doença. Então, por que anticorpos não estão sendo usados na  acondroplasia? Esta é uma ótima pergunta e a explicação reside no interior do corpo. Existem várias camadas de defesa montadas pelo nosso corpo para nos proteger de invasores, mas, no caso dos ossos, qualquer droga ou composto terá de lidar não só com o sistema imunológico, mas também com uma fortaleza muito bem protegida, a cartilagem da placa de crescimento.

A cartilagem da placa de crescimento

Tendo dito dessa forma, vamos dar uma olhada na placa de crescimento. Vamos devagar para nos ajudar a refletir sobre o desafio. A melhor maneira de chegar a um lugar é aprender primeiro o máximo que se pode sobre o trajeto, de modo a estar preparado para os obstáculos do caminho. Esteja preparado, para ir a uma montanha com neve, pegue algumas correntes para as rodas, para uma praia tropical quente e remota é bom ter um carro apropriado para atravessar estradas não pavimentadas. E, claro, trazer as roupas certas. Você não vai querer sentir frio enquanto desce a montanha sobre esquis ou nadar usando um casaco de lã.

A placa de crescimento protege os poderosos condrócitos

A cartilagem da placa de crescimento é a fonte de crescimento do osso. É através das estruturas que os condrócitos criam em torno de si dentro da placa de crescimento que o novo osso vai ser construído. Este é um bom passo por onde começar, mas como o crescimento é alcançado?

Dê uma olhada nesses diagramas que mostram ilustrações que representam a placa de crescimento:

• Diagrama 1
• Diagrama 2

E agora, veja a figura na página dos Drs. Naski e Ornitz, um par de pioneiros modernos no campo da cartilagem da placa de crescimento, que mostra como é a estrutura real da placa de crescimento.

Provavelmente, você agora já tem uma melhor visão de como a placa de crescimento é organizada.

Existem várias camadas de tipos distintos de condrócitos:

• A zona de repouso
• A zona proliferativa
• A zona pré-hipertrófica ou maturação
• A zona hipertrófica

A zona de repouso é composta por condrócitos inativos. Eles serão ligados por alguns estímulos químicos e começarão a proliferar (multiplicar), organizando-se em pilhas de células planas em sequência, acatando um sentido longitudinal. Em seguida, obedecendo a outros tipos de instruções químicas, eles vão começar a aumentar e arrendondar, começando a produzir grandes quantidades de matriz cartilaginosa (o material que os rodeia). Em algum momento, uma das proteínas que produzem, denominada fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), vai provocar a formação de vasos sanguíneos na área circundante. Esses vasos invadem a matriz cartilaginosa e abrem caminho para novas células, os osteoblastos, precursores do osso. Ao mesmo tempo, os condrócitos hipertróficos entram em morte celular programada, um fenômeno chamado apoptose. Os espaços que eles deixam serão ocupados pelos osteoblastos que chegam e que começam a produzir a matriz óssea (na página dos Drs. Naski e Ornitz - link acima - você encontra uma descrição mais detalhada deste processo).

Há um conceito que nós precisamos ter em mente, que é o fato de que as zonas de repouso e proliferativa da placa de crescimento não têm suprimento direto de sangue. É provávelmente uma das muitas maneiras encontradas pela Evolução para proteger esse tecido tão sensível.

Para atingir os condrócitos, qualquer mensageiro do corpo, hormônios, nutrientes ou outra molécula terá de navegar através da matriz cartilaginosa, o tecido produzido por estas células. Esta matriz é composta por várias proteínas muito grandes chamadas de colágenos e de complexos sulfatados de moléculas de açúcar, conhecidos como glicosaminoglicanos, além de outras moléculas complexas, todos organizados em uma rede intrincada.

Este meio é responsável por sustentar o formato da cartilagem, mas também é responsável pelo bloqueio de moléculas indesejadas ou invasores. Aqui, novamente, este parece ser um outro toque da Evolução para proteger os condrócitos em sua missão crucial.

Então, como importante mensageiros do corpo tais como o hormônio do crescimento (GH) ou nutrientes fazem seu caminho para os condrócitos?

Esta é a primeira regra para a qual devemos prestar atenção. O GH e vários outros hormônios do corpo são pequenas moléculas, assim como muitos nutrientes comuns também são. Um elegante estudo realizado por Farnum et al. mostrou que as moléculas de peso inferior a 50 kDa tenderão a difundir mais facilmente através da placa de crescimento.

Esse padrão de difusão explica porque anticorpos específicos contra o FGFR3, disponíveis para teste, provavelmente não conseguem chegar aos condrócitos em doses terapêuticas: eles são muito grandes, pesando mais de 150 kDa. Este não é um problema para os peptídeos (tais como o CNP), oligonucleotídeos e os pequenos inibidores de tirosina quinase (TKI).

Outra reflexão sobre a matriz da cartilagem é que é provável que qualquer composto terapêutico vai levar tempo para atingir a meta, devido às características de difusão, e dessa forma aqueles que pesquisam medicamentos devem pensar em como lidar melhor com dados provenientes de estudos de farmacocinética. Por exemplo, a meia-vida (uma maneira de medir o tempo que uma droga irá circular no interior do corpo) pode não refletir bem a distribuição da droga.

O que vem a seguir?

Sabemos que vários fármacos, como os listados acima, pode chegar à placa de crescimento. Você viu o artigo descrevendo os efeitos da PD106067 na cartilagem? Os TKIs atravessam a placa de crescimento e alcançam os condrócitos, por isso, se pudermos criar um desses compostos com ação exclusiva sobre o FGFR3, poderia ser suficiente para resgatar o crescimento ósseo na acondroplasia.

No entanto, para outras estratégias terapêuticas razoáveis, tais como oligonucleotídeos ou aptâmeros, o problema está relacionado não ao tamanho da molécula, mas a sua natureza. Uma vez que possuem características químicas particulares, não serão capazes de atingir a placa de crescimento por si só, porque a defesa imunológica os pararia rapidamente. Eles terão de ser levados para a placa de crescimento por sistemas de transporte. Falaremos mais sobre isso no próximo artigo.

Em resumo, fizemos uma breve revisão das propriedades da placa de crescimento e os desafios que ela representa para o desenvolvimento de drogas. Algumas das abordagens terapêuticas, tais como os TKIs, já provaram alcançar os condrócitos e a questão aqui é sobre encontrar o TKI perfeito, que afete apenas o FGFR3, uma tarefa muito difícil com a tecnologia atual. Outras abordagens viáveis precisarão de ajuda para entrar na placa de crescimento e alcançar os condrócitos.

The last stronghold: the growth plate cartilage

Medicine has been efficiently tackling conditions caused by altered proteins the body produces, either because of a disease state or due to a mutation. Actually, doctors do have in hands a significant number of drugs of biological (antibodies) or synthetic origin which can be used to block these proteins to treat several diseases like cancer and rheumatic conditions. So now, illnesses like breast cancer can be defeated more easily and an affected woman has more chance to survive after the diagnosis if the right treatment is applied early. You can see more about an antibody against a protein produced by breast cancer cells here.

Achondroplasia is caused by a single substitution in one of the hundreds amino acids of the chain that form the protein, or enzyme, called fibroblast growth factor receptor type 3 (FGFR3). The amino acid change makes this enzyme more active than normal and, as the natural role of FGFR3 is to negatively regulate the bone growth pace, the result is that children bearing the altered protein will grow less than they could do. The medical and personal consequences are very well known.

Enzymes are proteins capable to cause or accelerate chemical reactions inside the body. They have distinct electric charges and patterns that make them good targets in terms of the creation of compounds or drugs that can react with them and block their functions. FGFR3 is no exception. In fact there is already an expressive list of antibodies and synthetic molecules capable of stopping FGFR3 activity (see the table below with a partial list).

Table. A list of drugs and antibodies with action against FGFR3.

If we already have so many usable tools, what is preventing achondroplasia to be readily treated? Why don’t simply pick one of the good antibodies available and give it to the affected child? FGFR3 would be blocked, the car brake would no more stop the car and growth would be rescued. It sounds pretty good, isn’t it?

The road is not that easy

 I know, I will be repeating a bit what is written in the older articles in this blog, but we will not lose anything by revisiting this topic. On the contrary, the idea here is not to just give information, but to share knowledge. With knowledge comes insight.

There are several important biological and economic reasons to explain why it has been so difficult to find good treatments for achondroplasia. In this article about the growth plate we will be looking only at the biological ones.

Of course, the growth plate it is not the only issue. One important reason which makes difficult to treat achondroplasia is related to FGFR3 structure. FGFR3 is one of a family of four receptor enzymes and shares great homology (similarity) with its brothers. Furthermore, for one of the most important reactive parts of its structure, which is called ATP pocket (reviewed here: ATP pockets), the homology is also significant with those of other receptor enzymes families. These patterns imply that many of the current synthetic drugs capable of blocking FGFR3 have also the same action in other FGFRs and in other enzymes. We want to block only FGFR3, as it could be dangerous to interfere in other body chemical reactions. Therefore, it is a huge challenge to design a drug to beat only FGFR3.

Antibodies against FGFR3 are more specific. Several have been created and one is currently being tested for some kinds of cancer where FGFR3 plays an important role stimulating the progression of disease. So, why are they not being used for achondroplasia? This is a great question and the explanation resides within the body. Several layers of defense have been mounted by our body to defend us from invaders, but in the case of the bones, any drug or compound will have to deal not only with the immune system but also with a very well protected stronghold, the cartilage growth plate.

The cartilage growth plate

Having this said, let’s take a look in the growth plate. We will do it slowly to help us reflect about the challenge. The best way to reach a place is to learn the most we can about the way to it first, so to be prepared for the hurdles of the path. Be prepared, for a snow mountain, pick some chains for the wheels, for a remote hot tropical beach is good to have an appropriate car to cross unpaved roads. And of course, bring the right clothes. You will not want to feel cold while going down the mountain on skis or swim using a fleece coat.

The growth plate protects the mighty chondrocytes

The cartilage growth plate is the source of bone growth. It is through the scaffold the chondrocytes create around themselves within the growth plate that the new bone will be built. This is a good step from where to start, so how the growth is achieved?

Take a look in these figures showing illustrated structures of the growth plate:

• Figure 1
• Figure 2

And now, just look at this picture for an actual growth plate structure, from the work of a pair of modern pioneers in the field of growth plate cartilage, Drs. Naski and Ornitz.

You now may have a nice understanding of how the growth plate is organized. There are several layers of distinct types of chondrocytes:

• The resting zone
• The proliferative zone
• The pre-hypertrophic or maturing zone
• The hypertrophic zone

The resting zone is comprised by sleepy chondrocytes. They will be turned on by some chemical stimuli and start to proliferate (multiply), organizing themselves in piles of flat cells following a longitudinal sense. Then, obeying other kind of chemical instructions, they will start to enlarge and will become round, beginning to produce large amounts of cartilaginous matrix. At some point, one of the proteins they produce, called vascular endothelial growth factor (VEGF) will trigger the formation of blood vessels in the surrounding area. These vessels invade the cartilaginous matrix and open way to new cells, the osteoblasts, precursors of bone. At the same time, the hypertrophic chondrocytes will enter programmed cell death, a phenomenon called apoptosis. The spaces they lay will be replenished by the incoming osteoblasts, which will begin to produce the bone matrix (in the page by Drs Naski and Ornitz – link above - you will be able to find a more detailed description of this process).

There is one concept we need to bear in mind, which is the fact that the resting and the proliferative zones of the growth plate do not have direct blood supply. It is likely one of the many ways Evolution found to protect this so sensitive tissue.

To reach the chondrocytes, any nutrient, hormone or other body messenger will have to navigate through the cartilage matrix, the tissue produced by these cells. This matrix is composed by several very large proteins called collagens and complex sulfated sugar molecules, all of them organized in an intricate net. 

This net is responsible to sustain the cartilage format, but it is also responsible for blocking undesired molecules or invaders. Here again, this seems to be another Evolution’s touch to protect the chondrocytes in their crucial mission.

So, how important messengers of the body such as growth hormone (GH) or nutrients make their way to the chondrocytes?

This is the first rule we should be pay attention to. GH and several other body hormones are small molecules, as many common nutrients are as well. An elegant study performed by Farnum et al. in 2006 showed that molecules weighing less than 50 kDa will tend to diffuse more easily across the growth plate.

This diffusion pattern explain why specific, ready to use antibodies fail to reach chondrocytes in therapeutic doses: they are too large, weighing more than 150 kDa. This is not a problem for peptides (such as the CNP), oligonucleotides and small tyrosine kinase inhibitors (TKI).

Another thought about the cartilage matrix is that it is likely that any given therapeutic compound will take time to reach the target due to the diffusion characteristics, so drug developers should think in how to better handle data coming from pharmacokinetics studies. For instance, half-lives (a way to measure the time a drug will circulate within the body) might not reflect fairly the drug distribution.

What does come next?

We know that several drugs, like those listed above, can reach the growth plate. Did you see the paper describing the effects of PD106067 in the cartilage? TKIs cross the growth plate and reach chondrocytes, so if we can create one of these compounds with exclusive action on FGFR3, it looks like we would be capable of rescuing bone growth in ACH.

However, for other reasonable therapeutic strategies, such as oligonucleotides or aptamers, the problem is related not to the size of the molecule but to its nature. As they have particular chemical characteristics, they will not be able to reach the growth plate by their own, because the immune defense would stop them very fast. They will need to be transported to the growth plate by carrier systems. We will talk more about this in the next article.

In summary, we have briefly reviewed the growth plate properties and challenges it poses for drug development. Some of the therapeutic approaches such as TKIs have been proven to reach the chondrocyte and the issue here is about to find the perfect TKI, that one addressing only FGFR3, a very difficult task with the current technology. Other feasible approaches will need help to get into the growth plate and reach chondrocytes.