Bloqueando a produção do FGFR3 para tratar a acondroplasia (parte 1)

Introdução

O blog tem atualmente 24 seguidores (é o que Google diz ...). Esses resilientes leitores provavelmente pensam que eu repito demais a mesma informação, pois os artigos muitas vezes começam com conceitos básicos sobre a acondroplasia antes de entrar no assunto. Isso é verdade, mas eu sei que às vezes outros visitantes passam por aqui, então é bom tentar colocar todos no mesmo passo. E, afinal de contas, sempre procuro incluir algo novo nessas introduções (e isso é verdade nesta aqui, também!).

Lendo novamente os artigos mais recentes, percebo que a linguagem e explicações, por vezes, podem parecer difíceis de entender para o leitor de primeira viagem. Se você acha que está sendo difícil entender alguns dos temas comentados aqui, dê uma olhada nos primeiros artigos do blog, escritos em 2012. Eles podem ajudar a trafegar mais facilmente através dos novos. Por exemplo, o tema deste artigo foi revisto em três artigos de 2012:

24/01/2012. Mirando na produção do FGFR3 para resgatar o crescimento ósseo na acondroplasia
12/02/2012. O mundo do RNA: desligando o FGFR3 na acondroplasia 
20/02/2012. O mundo do RNA: desligando o FGFR3 na acondroplasia, parte 2

E, em 2013, escrevi um outro artigo sobre este assunto:

18/06/2013. Interferindo na produção do FGFR3: uma potencial estratégia para tratar a acondroplasia

Pode ser útil você lê-los antes de continuar aqui, porque o tema tem suas complexidades.

Algumas informações básicas

A acondroplasia é causada por uma mutação no gene FGFR3, o qual codifica a (contem as instruções para a produção de) proteína chamada receptor de fator de crescimento de fibroblastos 3 (FGFR3) (1,2). O FGFR3 tem um papel fundamental no desenvolvimento ósseo, que é o de reduzir a velocidade de crescimento do osso (3). Ele funciona como um freio no interior das estreitas regiões localizadas em ambas as extremidades dos ossos longos chamadas de placas de crescimento (Figura 1). As placas de crescimento são as estruturas responsáveis ​​pelo alongamento dos ossos tubulares (ou longos). As células no interior da placa de crescimento, os condrócitos, são responsáveis pelo crescimento do osso através de um processo muito complexo, e o FGFR3 é parte dele.

Figura 1. A placa de crescimento.

 

Nas Figuras 1 e 2 você pode ver que os condrócitos da placa de crescimento são posicionados de uma forma que, sob estímulo contínuo de muitos agentes de crescimento ativos (FGFR3 incluído), partem de um estado de repouso (resting zone), passam por um organizado frenesi proliferativo (proliferative zone), são submetidos a um aumento maciço de volume (hypertrophic zone) e, finalmente, dão lugar às células responsáveis ​​pela construção do novo osso, os osteoblastos. Como um pequeno detalhe, alguns autores em revisões recentes têm considerado que o tamanho da zona hipertrófica é determinante para o alongamento do osso (4).

Figura 2. O ciclo de vida dos condrócitos e muitos dos agentes que participam no desenvolvimento do crescimento ósseo.



Como mencionado acima, o FGFR3 atua para equilibrar o efeito de vários outros agentes que estimulam a proliferação de condrócitos. Se não houvesse FGFR3, os ossos cresceriam excessivamente causando problemas de saúde, como vemos em casos relatados na literatura (5).

No entanto, na acondroplasia, a mutação no gene FGFR3 faz o FGFR3 ficar mais ativo do que o normal, o que por sua vez leva à interrupção do crescimento do osso. Sob o efeito de um FGFR3 superativo, condrócitos reduzem sua taxa de proliferação e menos deles sofrem hipertrofia (Figura 3). Com menos condrócitos amadurecendo e crescendo, a zona hipertrófica não atinge o seu pleno potencial e temos comprometimento do crescimento ósseo. Basicamente, quase todas as características clínicas e consequências para a saúde na acondroplasia podem ser explicadas por este mecanismo (4).

Figura 3. Placas de crescimento de um modelo de rato com acondroplasia (direita) e de um animal não afetado (à esquerda).

Compare os comprimentos das zonas proliferativas (PZ) e hipertroficas (HZ) entre as placas de crescimento normal e afetada. Adaptado e reproduzido aqui de Yingcai W et al. PNAS 1999;96:4455-60, somente para fins educativos.

A atividade do FGFR3 depende de sinais que vêm de fora dos condrócitos. Na Figura 4 você pode ver que o FGFR3 é como uma antena de TV, colocada no telhado da casa (membrana celular). Ele recebe sinais químicos trazidos por fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) que circulam na proximidade dos condrócitos, no interior da placa de crescimento. Quando um FGF liga a antena, um sinal químico atravessa o corpo da antena (o corpo do FGFR3) e aciona várias outras cascatas químicas no interior dos condrócitos (6). Digamos que é o FGFR3 ativo "apertando botões no painel de controle da célula".

Figura 4. As cascatas químicas intracelulares do FGFR3 (da Nature Reviews Cancer 2005).

Os cientistas têm agora uma boa compreensão de como o FGFR3 exerce a sua ação nos condrócitos, os "botões" que aperta para fazer os condrócitos pararem de crescer, embora não raro tragam mais detalhes para este processo.

Aprender sobre o mecanismo de ação das proteínas, tais como o FGFR3, é como criar um mapa com estradas destacando seus cruzamentos, pontos de checagem, estações de trem etc. Esse mapeamento permite que os pesquisadores trabalhem em soluções para superar a falta ou excesso de atividade dessas proteínas. Muitas terapias atuais para um grande número de doenças têm sido criadas com a ajuda desses mapas, uma vez que ajudam a encontrar os alvos corretos para combater uma determinada condição médica.

Pensando em terapias para a acondroplasia, como também para outras muitas doenças genéticas causadas por uma única proteína hiperativa, o movimento natural é o de encontrar um agente que possa interromper essa proteína de exercer a sua função. Teoricamente, isso poderia ajudar a reverter ou minimizar os seus efeitos.

Pode-se conseguir interromper a ação do FGFR3 por várias vias diferentes (olhe as "estações de trem" no mapa da cascata de sinalização na Figura 3), desde bloquear a recepção do sinal pela antena ou pelo bloqueio dos botões no painel de controle até o de contrabalançar o efeito de uma daquelas cascatas químicas, através do estímulo de uma cascata antagonista.

A maioria dessas estratégias já foi revista aqui no blog. Por exemplo, você pode bloquear a antena com anticorpos concebidos para conectarem-se a ela. Existem pelo menos três anticorpos contra o FGFR3 publicados na literatura, os quais têm sido explorados em estudos clínicos para o câncer ativado por FGFR3 (veja este artigo).

Você pode bloquear os botões no painel de controle com pequenas moléculas chamadas inibidores de tirosina quinase (TKI). Há muitos TKI disponíveis, mas até agora nenhum bom o suficiente para ser usado na acondroplasia (veja este artigo). E você também pode estimular outra antena da célula (outro receptor) para reduzir a atividade do FGFR3, como observamos com o vosoritide, um análogo do peptídeo natriurético tipo C (CNP), atualmente em um estudo clínico de fase 2 para a acondroplasia.O vosoritide imita o CNP ao se ligar ao seu receptor localizado na membrana celular do condrócito (como o FGFR3). O receptor é ativado e sua sinalização intercepta a MAPK, a principal cascata de sinalização do FGFR3, inibindo-a ao nível da "estação de trem" RAF (Figura 5) (veja este artigo).

Figura 5. A cascata de sinalização do CNP intercepta a cascata MAPK desencadeada pelo FGFR3.

Matsushita M et al. (2013). PLoS ONE 8 (12): e81569. Reproduzido aqui apenas para fins ilustrativos

Estes são apenas alguns exemplos entre outras diversas estratégias que já estão sendo exploradas para a acondroplasia (veja este artigo). No entanto, há outros tipos de abordagem que poderiam ser adequadas para controlar ou regular o FGFR3 e, depois desta longa introdução, vamos falar sobre uma delas, que seria a de bloquear a produção do FGFR3 (está no título, não é?). Na verdade, já a revisamos aqui no blog (os artigos noa no topo deste texto!, você chegou a lê-los?), Mas como há nova informação chegando, pensei que valeria a pena falar sobre ela novamente. Afinal, essa estratégia poderá nos ajudar a entrar em outra nova estratégia potencial que também lida com DNA, RNA e a maquinaria de transcrição de genes mais adiante.

Regulando o regulador

Como você deve saber, nosso DNA é uma espécie de cofre onde a informação química necessária para criar as proteínas fundamentais para o nosso corpo é armazenado. A vida é um processo dinâmico e existe sempre a necessidade de produzir novas proteínas de modo que as células, tecidos e o corpo como um todo possam funcionar normalmente (Animação 1, Inglês, 2:41min).

Animação 1. Do DNA à proteína (yourgenome.org).

A forma como o processo pelo qual o DNA é "lido" e "copiado" para gerar proteínas frequentemente pode conduzir a estados em que um determinado gene que codifica a informação para gerar uma proteína poderia ficar longamente "aberto" para ser "lido", de modo que a proteína poderia ser produzida sem parar. Isto, por sua vez, pode resultar em problemas de saúde. Por exemplo, alguns tipos de células cancerosas, como no câncer de mama, são capazes de iniciar a superprodução de "antenas", tais como o nosso FGFR3, para captar mais sinais externos em circulação que estimulam ainda mais o crescimento do câncer.

Em condições normais, este excesso de produção de proteínas não ocorre porque a célula tem várias medidas de controle de qualidade que funcionam para regular este processo. Uma delas é constituída por moléculas de RNA.

Mas, vamos devagar aqui, passo a passo. Lembro-me que, nos meus tempos de colégio, quando comecei a estudar biologia celular, havia três tipos clássicos de RNA: RNA mensageiro (mRNA), o RNA de transferência (tRNA) e o RNA ribossomal (todos eles aparecem na animação acima). Bem, desde então, a lista de tipos de RNA não parou de crescer. Dê uma olhada nesta página da Wikipedia (em inglês) para obter uma lista de tipos de RNA já identificados.

Algumas destas moléculas de RNA estão muito envolvidas no processo de controle da produção de proteínas e o foco aqui é a família microRNA, ou simplesmente miRNA (revisto nos artigos mencionados acima). Demonstrou-se que essas moléculas de RNA controlam a quantidade de proteínas produzidas pela célula. Convido você a assistir à Animação 2 (Inglês, 4:53min) por Katarina Petsche, a qual dá uma visão global da síntese do miRNA e de como ele funciona:

Animação 2. A síntese e mecanismo de ação do miRNA (por Katarina Petsche).

Basicamente, devido à capacidade de degradação de mRNAs, os miRNAs têm sido classificados como moléculas "silenciadoras de genes". Como a proteína-alvo não é produzida, é como se o gene não estivesse funcionando (ou desligado, silenciado).

Há milhares de miRNAs diferentes e cada um deles foi concebido para se ligar a um número limitado de mRNAs. Já se identificou vários miRNAs, tais como o miRNA-100 (ou miR-100), que se ligam ao mRNA do FGFR3, mas aqui temos um problema. Embora os miRNAs sejam muito específicos para os seus alvos, seus alvos não são únicos. Quando você pensa em "silenciamento" de um gene específico, digamos o FGFR3 na acondroplasia, não quer "silenciar" outros genes-alvo, uma vez que isso poderia levar a outros problemas de saúde.

Entre os vários miRNAs que mostraram exercer uma função de controle sobre o FGFR3, o miR-100 parece ser um dos mais relevantes, uma vez que há evidências de que ele realmente controla o FGFR3. Diversos estudos publicados recentemente exploraram a ligação entre o miR-100 e o FGFR3 no câncer pancreático (7), glioblastoma (8), sarcoma (9) e em células de câncer de pulmão (10) e mostraram que, nas células que "superproduzem" miR-100 havia menos FGFR3 disponível e vice-versa, e todos concluíram que o miR-100 foi capaz de inibir o crescimento do câncer nas suas experiências. Não se sinta confuso sobre o fato de que o FGFR3 é usado pelas células cancerosas paraa crescer. Isso acontece porque o FGFR3 é um freio somente para os condrócitos da placa de crescimento; em outras células ele funciona como um acelerador ... Estes tipos de descobertas podem conduzir ao desenvolvimento de uma estratégia de estímulo de expressão (de produção) de miR-100 nas células de câncer que utilizam o FGFR3 para crescer, para silenciar o gene FGFR3 e combater o tumor.

Então, se uma abordagem como essa poderia ser usada para o tratamento do câncer, o miR-100 ou outros miRNAs são adequados para tratar a acondroplasia?

Provavelmente não, porque, embora exista evidência de que eles inibem o FGFR3, também existem outras proteínas que podem ser afetadas por suas ações, o que poderia trazer problemas indesejáveis. Em resumo, miRNAs não são suficientemente específicos.

Bem, então, qual é o objetivo desta revisão? A coisa é que os pesquisadores foram capazes de criar, em laboratório, um outro tipo de RNA que faz basicamente o mesmo que que os miRNAs (aprender um pouco sobre um, é aprender sobre o outro...). No entanto, há uma diferença importante: como é sintetizado no laboratório, provavelmente terá especificidade muito maior para o FGFR3. Esta molécula de RNA sintética é chamada de pequeno RNA de interferência (small interference RNA) ou simplesmente siRNA. Estudos já realizados mostram que siRNAs usam a mesma maquinaria celular e causam efeitos similares aos dos miRNAs (11). Os investigadores têm de introduzir o siRNA no interior da célula e depois ele funciona como um miRNA. Hoje em dia, uma abordagem "simples" para provar que um gene é ligado a uma determinada função é a de aplicar um siRNA específico e observar os efeitos de silenciamento daquele gene. Por exemplo, isso foi feito em diversos contextos de doenças (11) e também na acondroplasia, em um estudo realizado por Pintor e Legeai-Mallet (12).

Se você leu o artigo de 2013 sobre RNAs você já sabe que pelo menos uma empresa de biotecnologia com sede nos EUA (Marina Biotech) patenteou uma estratégia de interferência de RNA como possivelemtne útil para o tratamento de acondroplasia (13). Agora, descobri uma outra patente para o uso de moléculas de ácidos nucleicos para tratar a acondroplasia (14) (Santaris Pharma, Roche), então parece que tem havido algumas tentativas recentes para atingir o FGFR3 na acondroplasia usando a estratégia siRNA.

Não sabemos se estas abordagens chegarão ao desenvolvimento clínico porque um dos principais desafios para as terapias à base de ácidos nucleicos (RNA é composto por ácidos nucleicos, como você sabe) é como fazer esses agentes atingirem os seus objetivos. Como as moléculas de RNA são tão poderosas, o corpo tem um grande número de agentes de proteção para garantir que essas moléculas não trafegarão livremente por muito tempo. RNA é o código genético de muitos vírus causadores de doença, e o corpo deve estar pronto para se livrar de ácidos nucleicos estranhos para se defender de infecções. Portanto, as moléculas de RNA tendem a ser rapidamente degradados por enzimas neutralizantes, e isto poderia explicar em parte por que não vemos progressos rápidos nesta área. Para a acondroplasia, o desafio é ainda maior porque as células-alvo, os condrócitos, estão em um ambiente muito bem protegido, a cartilagem da placa de crescimento, um lugar difícil de alcançar (ver este artigo anterior do blog).

Entregando a encomenda

A entrega a domicílio é realmente um desafio, e por esta razão usei o verbo "introduzir" quando eu descrevi o uso do siRNA três parágrafos acima. Não é fácil fazer moléculas de RNA chegarem ao interior das células, você precisa usar um táxi (o que se chama de transportador, vetor etc.) ou um disfarce. Por exemplo, em vários estudos foram aplicados apêndices na molécula de RNA, o que as tornou mais estáveis ​​e resistentes à neutralização por enzimas. Em doenças em que a célula alvo está num tecido com fluxo direto de sangue, isto pode ser suficiente para permitir que o siRNA entre na célula, mas em um tecido, tal como a placa de crescimento, onde não existe um fluxo sanguíneo direto, como isso pode ser alcançado?

Esta não é uma questão trivial. Uma estratégia possível para fazer uma droga chegar ao seu alvo é encontrar algo que somente esse alvo tem (como um marcador), o que não é uma tarefa fácil, mas ainda assim viável. No caso dos condrócitos da placa de crescimento possivelmente um destes marcadores é um receptor de células (outra antena) chamado CD44. O problema aqui é que o CD44 é expresso por muitas células diferentes. Então, é inútil? Talvez não, porque a maioria das células que possuem CD44 não expressam FGFR3 em um nível significativo, de modo algum influência de um siRNA contra o FGFR3 nelas possivelmente não iria causar qualquer problema. A ideia seria anexar ou cobrir a molécula de RNA a uma outra molécula que pode ligar-se ao CD44. Uma vez ligado, o sistema celular que mantem o equilíbrio das antenas traria este CD44 ocupado para o interior da célula, onde o siRNA seria liberado para encontrar o seu alvo e exercer a sua função esperada. Esta é apenas uma ideia pessoal, nunca encontrei qualquer trabalho que explorasse esta abordagem nesta área específica.

Conclusão

Pode parecer que esta revisão não ajudou muito em termos de trazer uma nova terapia potencial espetacular para acondroplasia. Seria mais como uma revisão geral da doença, uma vez que o blog já tem artigos sobre miRNAs e siRNAs. No entanto, não estamos perdendo tempo: os processos brevemente mencionados aqui servirão para ajudar-nos a viajar por um ainda mais complexo, que é a edição de genes, uma estratégia terapêutica potencial que está sob os holofotes agora.

Poderia ser usada para tratar a acondroplasia?

Pelo que eu já aprendi, diria que sim, mas vamos ver no próximo artigo. Ainda estou estudando este tópico ...


Referências

1.Bellus GA et al. Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995;56(2):368-73. Free access.

2.Rousseau F et al. Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in
achondroplasia. Nature 1994;371(6494):252-4. Free access.

3. Laederich MB and Horton WA. FGFR3 targeting strategies for achondroplasia.Expert Rev Mol Med 2012;14:e11.

4. Narayana J and Horton WA. FGFR3 biology and skeletal disease. Connect Tissue Res 2015;56(6):427-33.

5. Makrythanasis P et al. A novel homozygous mutation in FGFR3 causes tall stature, severe lateral tibial deviation, scoliosis, hearing impairment, camptodactyly, and arachnodactyly. Hum Mutat 2014;35(8):959-63.

6. Ornitz DM and Marie PJ. Fibroblast growth factor signaling in skeletal development and disease. Genes Dev. 2015 Jul 15;29(14):1463-86. Free access.7. Li Z et al. MicroRNA-100 regulates pancreatic cancer cells growth and sensitivity to chemotherapy through targeting FGFR3. Tumour Biol 2014;35(12):11751-9.

8. Luan Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits cell proliferation, migration, and chemosensitivity in human glioblastoma through FGFR3. Onco Targets Ther 2015;8: 3391-400. Free access.

9. Bi Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits growth of osteosarcoma through FGFR3.Tumour Biol 2015;36(11):8405-11.

10. Luo J et al. Overexpression of miR-100 inhibits cancer growth, migration, and chemosensitivity in human NSCLC cells through fibroblast growth factor receptor 3.Tumour Biol 2015; published online Aug 28. DOI 10.1007/s13277-015-3850-z.

11.Videira M et al. Preclinical development of siRNA therapeutics: towards the match between fundamental science and engineered systems.Nanomedicine 2014;10(4):689-702.

12. Guzman-Aránguez A, Legeai‐Mallet L, Pintor J. Fibroblast growth factor receptor 3 inhibition by small interfering RNAs in achondroplasia. Anales Real Acad Nac Farm 2011; 77(1).

13. Marina Biotech Patent WO 2011139842 A2. Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof.

14. Santaris Pharma WO 2014080004 A1. Compositions and methods for modulation of fgfr3 expression.

Stopping FGFR3 production to treat achondroplasia (part 1)

Introduction

This blog currently has 24 followers (that's what Google tells me...). These resilient readers likely think I repeat the same information too much, as the articles often come with some basic concepts about achondroplasia before getting into the subject. That's true, but I know that sometimes other visitors pass by so it's good to try to have everybody in the same pace. And, after all, I always try to include a bit of new information in these short introductions (and this is true in this one, too!).

Reading again the more recent articles, I perceived that the language and explanations sometimes might sound hard to understand for the first-time reader. If you think it has been difficult to get into some of the topics we review here, take a look in the first articles of the blog, written in 2012. They may help you to travel more easily across the new ones. For instance, the topic in this article have been reviewed in three articles back in 2012:

22/01/2012. Targeting FGFR3 production to rescue bone growth in achondroplasia
04/02/2012. The RNA World: knocking down FGFR3 in achondroplasia

20/02/2012. The RNA World: knocking down FGFR3 in achondroplasia, part 2 

And, in 2013, I wrote another article about this subject:

16/06/2013. Interfering in the production of FGFR3: a potential strategy to treat achondroplasia

It may be helpful for you to read them before continuing here, because the topic has its complexities. 

Some basic information 

Achondroplasia is caused by a mutation in the gene FGFR3 that encodes (gives instruction for the production of) a protein called fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) (1,2). FGFR3 has a fundamental role in bone development, which is to reduce bone growth velocity (3). It works like a brake within the thin regions located in both extremities of the long bones called growth plates (Figure 1). Growth plates are the structures responsible for long bone elongation. The cells inside the growth plate, the chondrocytes, drive bone growth through a very complex process, and FGFR3 is part of it.

Figure 1. The growth plate.

In Figures 1 and 2 you can see that the growth plate chondrocytes are organized in a way that, under continuous stimuli from many active growth agents (FGFR3 included), begin from a dormant status (resting zone), run into an organized proliferation frenzy (proliferative zone), undergo massive enlargement (hypertrophic zone) and finally give place to the cells responsible for building the new bone, the osteoblasts. As a piece of detail, some authors in recent reviews have been considering that the size of the hypertrophic zone is determinant for the elongation of the bone. (4)

Figure 2. The chondrocyte lifecycle and many of the agents participating in bone growth development.

As just mentioned above, FGFR3 acts to balance the effect of several other agents that stimulate chondrocytes to proliferate. If there was no FGFR3 at all, bones would grow excessively causing health problems, as we see in reported cases in the literature (5).

However, in achondroplasia, the mutation in the gene FGFR3 makes FGFR3 to be more active than normal, which in turn leads to bone growth arrest. Under effect of the super active FGFR3, chondrocytes reduce their proliferation rate and less of them undergo hypertrophy (Figure 3). With less chondrocytes maturing and growing, the hypertrophic zone does not reach its full potential and we have bone growth impairment. Basically, almost all the clinical features and health consequences of achondroplasia can be explained by this mechanism (4).

Figure 3. Growth plates from a mouse model of achondroplasia (right) and wild type (left).

Compare the lengths of the proliferating zones (PZ) and hypertrophic zones (HZ) between the normal and the affected growth plates. Adapted and reproduced here from Yingcai W et al. PNAS 1999;96:4455-60, for educational purposes only.

FGFR3 activity depends on signals that come from outside the chondrocytes. In figure 4 you can see that FGFR3 is like a TV antenna, placed in the roof of the house (the cell membrane). It receives chemical signals brought by fibroblast growth factors (FGFs) circulating in the vicinity of the chondrocytes inside the growth plate. When a FGF binds the antenna, a chemical signal runs across the antenna pole (the body of FGFR3) and triggers several other chemical cascades inside the chondrocytes (6). Let’s say it is the active FGFR3 “pushing buttons on the cell control panel”.

Figure 4. FGFR3 chemical cascades (from Nature Reviews Cancer 2005)

Scientists now have a good understanding of how FGFR3 exerts its action in the chondrocytes, the “buttons” it pushes to make chondrocytes stop growing, although not infrequently they bring more details to this process.

Learning about the mechanism of action of proteins such as FGFR3 is like creating a route map highlighting their crossroads, checkpoints, train stations, etc. This mapping allows researchers to work on solutions to overcome lack of or excessive activity of these proteins. Many current therapies for a large number of diseases have been created with the aid of these maps since they help to find the right targets to beat a given medical condition.

Thinking in therapies for achondroplasia, as for other many genetic disorders caused by a single overactive protein, the natural move is to find an agent that could stop that protein to exert its function. Theoretically, this could help reverting or minimizing its effects.

Stopping FGFR3 actions can be achieved through several different approaches (look the "train stations" in the signaling cascade map in Figure 3), from blocking the signal reception by the antenna or blocking the buttons in the control panel to counterbalancing the effect of one of those chemical cascades by stimulating an antagonistic one.

Most of these strategies have been already reviewed here in the blog. For instance, you can block the antenna with antibodies designed to bind it. There are at least three antibodies against FGFR3 published in the literature that have been explored in clinical studies for cancers driven by FGFR3 (see this article).

You can block the buttons on the control panel with small molecules called tyrosine kinase inhibitors (TKIs). There are many TKIs available, but so far none good enough to be used in achondroplasia (see this article). And you can also stimulate another cell antenna (or receptor) to reduce the activity of FGFR3, as we have been witnessing with vosoritide, a C-type natriuretic peptide (CNP) analogue currently in phase 2 clinical trial for achondroplasia.Vosoritide imitates CNP by binding its receptor located at the chondrocyte cell membrane (like FGFR3 is). The receptor is activated and its signaling intercepts MAPK, the FGFR3 main signaling cascade, inhibiting it at the level of the "train station" RAF (Figure 5) (see this article).

Figure 5. CNP signaling cascade intercepts the MAPK cascade triggered by FGFR3.

Matsushita M et al. (2013). PLoS ONE 8(12): e81569. doi:10.1371/journal.pone.0081569. Reproduced here for illustration purposes only

These are only some examples among other several strategies already being explored for achondroplasia (see this article). Nevertheless, there is another kind of approach that would be suitable to control or regulate FGFR3 and, after this long introduction, let’s talk about one of them, which would be targeting the production of FGFR3 (it’s in the title, isn’t it?). In fact, we have already reviewed it here in the blog (listed in the top of the article!, did you read them?), but as new information is coming, I thought it would worth to talk about it again. And finally, it may help get into another new potential strategy that also deals with DNA, RNA and the transcription machinery later.

Regulating the regulator 

As you might know, our DNA is a kind of vault where the chemical information needed to create the proteins fundamental for our body is stored. Life is a dynamic process and there is always the need to produce new proteins so the cells, tissues and the body as a whole can function normally (Animation 1, English, 2:41min). 

Animation 1. From DNA to protein (by yourgenome.org).

The way the process by which the DNA is “read” and “copied” to generate proteins often could lead to states where a given gene that encodes the information to generate a protein could be extensively “open” for reading, so the protein could be produced nonstop. This in turn could result in health problems. For example, some kinds of cancer cells, like in breast cancer, are able to start the super production of “antennas” like our FGFR3 to gain advantage of circulating signals that trigger more cancer growth.

In normal conditions, this over production of proteins doesn’t occur because the cell has several quality control measures that work to regulate this process. One of them is comprised by RNA molecules.

But, let’s go slowly here, step by step. I remember in my high school days, when I started to study cell biology, that there were three classical kinds of RNA: the messenger RNA (mRNA), the transfer RNA (tRNA) and the ribosomal RNA (al of them appear in the animation above). Well, since then the list of RNA types has not stopped to grow. Take a look in this Wikipedia page for a list of already identified RNA types. 

Some of these many RNA molecules are involved in the process of controlling the protein production and the focus here is the microRNA, or simply miRNA family (reviewed in those articles mentioned above). These RNA molecules have been shown to control the amount of proteins produced by the cell. Let me invite you to watch the Animation 2 (English, 4:53min) by Katarina Petsche that gives an overall view of miRNA synthesis and how it works:

Animation 2. miRNA synthesis and function (by Katarina Petsche).

Basically, because of their ability of leading mRNAs to degradation, miRNAs have been classified as "gene silencing" molecules. As the target protein is not produced after all, it is as though the gene was not working (or shut down, silenced). 

There are thousands of different miRNAs and each of them is designed to bind to a limited number of mRNAs. There is already a number of miRNAs identified, like miRNA 100 (or miR-100), that bind to the FGFR3 mRNA, but here we have a problem. Although miRNAs are very specific for their targets, there targets are not unique. When you think in "silencing" a specific gene, let's say FGFR3 in achondroplasia, you don't want to silence other target genes, since this could lead to other health problems.

Among the several miRNAs that have been showed to exert a control function over FGFR3, miR-100 seems to be one of the most relevant, since there is mounting evidence that it does control/silence FGFR3. Several recently published studies explored the connection between miR-100 and FGFR3 in pancreatic cancer (7), glioblastoma (8), sarcoma (9) and  in lung cancer cells (10) showed that in those cells overexpressing (over producing) miR-100 there was less FGFR3 available and vice versa and all concluded that miR-100 was able to inhibit cancer growth in their experiments. Don't feel confused about the fact that FGFR3 is used by cancer cells to grow. This happens because FGFR3 is a brake only for growth plate chondrocytes; in other cells it works like an accelerator... These kind of findings may lead to the development of a strategy where miR-100 expression (production) could be stimulated in those cancer cells which use FGFR3 to grow, to silence the FGFR3 gene and beat the tumor.

So, if such an approach could be used for the treatment of cancer, are miR-100 or other miRNAs suitable to treat achondroplasia?

Probably not, because although the evidence exists that they do inhibit FGFR3, there are also other proteins that may be affected by their actions, which could bring undesired problems. In summary, miRNAs are not specific enough.

Well, then, what is the purpose of this review? The thing is that researchers have been able to create, in the lab, another kind of RNA which does basically the same of what miRNAs do (learning a bit about one, is learning about the other, you see...). However, there is a strong difference: it is made by design, and probably will have much more specificity for FGFR3. This synthetic RNA molecule is called small interference RNA or simply siRNA. Studies already made show that siRNAs use the same cell machinery and cause effects like miRNAs (11). Researchers have to introduce the siRNA inside the cell and after that it works like a miRNA. Today, a "simple" approach to prove that a gene is linked to a determined function is to apply a specific siRNA and watch the effects of silencing that gene. For instance, this has been done in several other disease contexts (11), including achondroplasia, in a study by Pintor and Legeai-Mallet (12).

If you read the 2013 article about RNAs you already know that at least one biotech based in US (Marina Biotech) has patented an RNA interference strategy pledging their utility to treat achondroplasia (13). Now, I have found another patent for the use of nucleic acid molecules to treat achondroplasia (14) from Santaris Pharma (Roche), so it looks like there have been some attempts to target FGFR3 in achondroplasia using the siRNA strategy lately. 

We don't know if these approaches will reach clinical development because one of the key challenges for nucleic acid-based therapeutic strategies (RNA is composed by nucleic acids, as you know) is how to make those agents reach their targets. Because RNA molecules are so powerful, the body has a vast number of protective agents to ensure these molecules will not traffic freely for long. RNA is the genetic code of many causing disease viruses, so the body must be ready to get rid of foreigner nucleic acids to defend itself from infections. Therefore, RNA molecules tend to be degraded rapidly by neutralizing enzymes, so this could partially explain why we don't see fast progress in this area. For achondroplasia, the challenge is even greater because the target cells, the chondrocytes, leave in a very well protected environment, the growth plate cartilage, a place tough to reach (see this previous article of the blog).

Delivering the package

Delivery is really challenging, and for this reason I used the verb "to introduce" when I described the use of siRNA just three paragraphs above. It is not easy to make RNA molecules go inside cells, you have to use a taxi (what is called transport, carrier, vector, etc.) or a disguise. For example, several studies applied appendages to the RNA molecule so it became more stable and resistant to neutralizing enzymes. For diseases where the target cell lies in a tissue with direct blood flow, this could be enough to allow the siRNA to enter the cell, but for a tissue such as the growth plate, where there is no direct blood flow, how can this be achieved?

This is not a trivial question. One possible strategy to deliver a drug to the target is to find something that only that target has (a marker), which is not an easy task, but still feasible. In the case of the growth plate chondrocyte, possibly one of these markers is a cell receptor (another antenna) called CD44. The issue here is that CD44 is expressed by many different cells. So, is it useless? Maybe not, because most of the cells that have CD44 do not express FGFR3 in a significant level, so some influence of a siRNA against FGFR3 on them possibly would not cause any trouble. The idea would be to attach or cover the RNA molecule to another molecule that can bind to CD44. Once connected, the cell system that manage the good shape of the antennas would bring the busy CD44 inside the cell where the siRNA could be released to find its target and exert its expected function. This is just a personal idea, I never found any work exploring this approach in this specific area.

Conclusion

It could sound that this review didn't help much in terms of bringing another new spectacular potential therapy for achondroplasia. It would be more like a general review of the disorder, since the blog already has reviews about miRNAs and siRNAs. However, we are not wasting time: the processes briefly mentioned here will serve to help us to travel across an even more complex one, which is gene editing, a potential therapeutic strategy that is under the spotlight now.

Could it be used to treat achondroplasia?

From what I have already learned, I would say yes, but let's see in the next article. I am still studying this topic...


References

1.Bellus GA et al. Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995;56(2):368-73. Free access.

2.Rousseau F et al. Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in
achondroplasia. Nature 1994;371(6494):252-4. Free access.

3. Laederich MB and Horton WA. FGFR3 targeting strategies for achondroplasia.Expert Rev Mol Med 2012;14:e11.

4. Narayana J and Horton WA. FGFR3 biology and skeletal disease. Connect Tissue Res 2015;56(6):427-33.

5. Makrythanasis P et al. A novel homozygous mutation in FGFR3 causes tall stature, severe lateral tibial deviation, scoliosis, hearing impairment, camptodactyly, and arachnodactyly. Hum Mutat 2014;35(8):959-63.

6. Ornitz DM and Marie PJ. Fibroblast growth factor signaling in skeletal development and disease. Genes Dev. 2015 Jul 15;29(14):1463-86. Free access.7. Li Z et al. MicroRNA-100 regulates pancreatic cancer cells growth and sensitivity to chemotherapy through targeting FGFR3. Tumour Biol 2014;35(12):11751-9.

8. Luan Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits cell proliferation, migration, and chemosensitivity in human glioblastoma through FGFR3. Onco Targets Ther 2015;8: 3391-400. Free access.

9. Bi Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits growth of osteosarcoma through FGFR3.Tumour Biol 2015;36(11):8405-11.

10. Luo J et al. Overexpression of miR-100 inhibits cancer growth, migration, and chemosensitivity in human NSCLC cells through fibroblast growth factor receptor 3.Tumour Biol 2015; published online Aug 28. DOI 10.1007/s13277-015-3850-z. 

11.Videira M et al. Preclinical development of siRNA therapeutics: towards the match between fundamental science and engineered systems.Nanomedicine 2014;10(4):689-702.
 
12. Guzman-Aránguez A, Legeai‐Mallet L, Pintor J. Fibroblast growth factor receptor 3 inhibition by small interfering RNAs in achondroplasia. Anales Real Acad Nac Farm 2011; 77(1).

13. Marina Biotech Patent WO 2011139842 A2. Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof. 

14. Santaris Pharma WO 2014080004 A1. Compositions and methods for modulation of fgfr3 expression.

Interfiriendo en la producción del FGFR3: una estrategia en potencial para tratar la acondroplasia

Traducción: Maria Cristina Terceros

En varios artículos anteriores de este blog revisamos algunos conceptos, tales como: ¿Qué es el DNA? y ¿Cómo proteínas tales como el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos del tipo 3 (FGFR3) son producidas. Sin embargo, como esta vez el tema se refiere exactamente a una estrategia que intenta inhibir la expresión (producción) del FGFR3, creo que vale la pena revisar el tema nuevamente.

El lector debe tener en mente que este texto es como una visión panorámica del tema, con muchos detalles retirados a propósito, para hacer con que sea más fácil de entender. Nosotros hablaremos apenas del FGFR3 y de los condrocitos de la placa de crecimiento, ya que las reacciones pueden darse de manera ligeramente diferente en otras condiciones o tejidos del cuerpo.

Para algunos de los lectores que siguen este blog, el texto puede hasta parecer repetitivo, con informaciones ya conocidas. Sin embargo, cuando el tema ya fue visto anteriormente, intento incluir algunos detalles extras, ya que así, juntos, seremos capaces de aumentar nuestro conocimiento. Y, finalmente, para este texto prepare un glosario simple localizado antes de las referencias. Las palabras en itálico recibieron una explicación corta y, si el texto puede llegar a parecer difícil de ser entendido, espero que ayude en algo. Algunos de estos términos también tienen links (enlaces) para otros sites (páginas web) que contienen más información sobre ellos.

 Cómo es hecho el FGFR3

Revisamos este proceso en una serie de tres artículos publicados al inicio de 2012 y se los puede encontrar presionando en el sector Español en lo alto de la página. Busca los artículos que mencionan producción de FGFR3 y el mundo del RNA.

En resumen

El FGFR3 es una proteína activa (una enzima), una gran molécula hecha de otras más pequeñas llamadas aminoácidos. Piensa en el FGFR3 como si se tratase de una larga cadena de bloques pequeños de Lego (aminoácidos), cada uno de ellos teniendo cargas eléctricas distintas. Cuando se llega a la estructura final del bloque, esta enzima receptora obtiene sus propiedades eléctricas funcionales. Sin embargo, fabricar una enzima funcional depende de un largo proceso de montaje.

El DNA es una especie de cofre donde están guardadas todas las instrucciones necesarias para crear proteínas. Cuando el condrocito recibe una señal química instruyendo a la célula a producir más FGFR3, un proceso multipasos comienza abriendo el cofre.

En primer lugar, factores de transcripción se unen a determinados trechos del DNA antes del punto donde el gen FGFR3 está ubicado. Cuando un factor de transcripción hace eso, otras proteínas nucleares locales son activadas y forman un complejo que comenzará a “leer” la secuencia del gen (transcripción) para producir una cadena de RNA que muestra como en un espejo lo que está escrito en el DNA. Esta cadena de RNA es denominada pre RNA mensajero, o simplemente pre-mRNA. Se puede ver estos videos de corta duración (animación 1 y animación 2, ambos en inglés) para tener una idea de cómo la transcripción funciona.

La cadena de RNA creada en el proceso de transcripción contiene toda la información existente en la secuencia del DNA del gen, de manera que posee, no solamente las secuencias de nucleótidos que van a dar lugar a las proteínas (llamadas de exones), pero también aquéllas que son hechas de secuencias no codificantes (llamadas de intrones). De esta manera, antes de que el mRNA pueda ser leído y traducido en una proteína, necesita ser liberado de esas partes que no contienen informaciones útiles.

Después de este paso, el mRNA maduro es dirigido hacia el citoplasma donde se unirá a otro conjunto de proteínas, dentro de los ribosomas, iniciando el proceso llamado translación, que conducirá a la producción del FGFR3.

Este corto-metraje animado bastante interesante de la Revista Nature nos ayudará a comprender el proceso de traslación. Prestemos atención a los últimos 20 segundos. Las pequeñas moléculas que se unen al mRNA en el ribosoma portan el aminoácido correcto, de acuerdo con la secuencia de nucleótidos del mRNA. ¿Ya te diste cuenta que parecen tenedores de tres puntas? Existe un motivo para eso. Cada aminoácido es elegido de acuerdo con grupos constituidos por tres nucleótidos, conocidos como codones.

En la acondroplasia, una alteración de un único nucleótido de uno de esos codones de la cadena del gen FGFR3 (ubicado en la posición 1138) provoca el cambio de un aminoácido en la posición 380 de la proteína FGFR3. Esto es suficiente para producir las características clínicas de la acondroplasia. En este artículo anterior del blog hay una explicación más detallada de la mutación que provoca la acondroplasia.

Sin embargo, la transcripción es un proceso altamente controlado y algunos pasos adicionales suceden antes de que el FGFR3 sea producido y liberado para ejercer sus acciones. Uno de esos pasos es realizado por otro tipo de molécula de RNA, denominado micro-RNA, o simplemente miRNA. La acción principal de los miRNAs es de reglamentar la expresión de proteínas y ellos hacen eso uniéndose a secuencias específicas del mRNA, interfiriendo con ellos y así interrumpiendo su lectura en el ribosoma y, consecuentemente, la producción de la proteína. (1) Se supone que la función del miRNA está relacionada con la manutención del equilibrio de la expresión de proteínas que, caso contrario, fuesen producidas continuamente, podrían causar enfermedades. Existe por lo menos un miRNA ya identificado cuyo objetivo natural es el FGFR3. (2)

Terapias potenciales para acondroplasia

Cuando observamos las actuales estrategias potenciales de tratamiento disponibles publicamente para la acondroplasia, podemos concluir que todas se dirigen hacia el receptor después de que él es producido, o contra las reacciones químicas ligadas a la actividad del FGFR3. Esto incluye a los inhibidores de tirosina quinase, CNP, PTH/ PTHrP, aptámeros, péptidos, armadillas de ligante y anticuerpos. Con la posible excepción de la hipótesis todavía no comprobada de que la MK-4 puede inhibir la producción de FGFR3 en condrocitos, ninguna de estas estrategias está dirigida contra la producción del FGFR3.

Pero, y si hay alguien en busca de esto? Hace unas semanas, durante una encuesta que realicé mientras escribía el artículo anterior de el blog sobre los aptámeros, descubrí un registro de patentes que de inmediato me llamó la atención.

Interfiriendo con la producción del FGFR3

La empresa estadounidense de biotecnología llamada Marina Biotech patentó un grupo de moléculas concebidas para interferir con la producción del FGFR3, a través del denominado proceso de interferenciade RNA. (2) La interferencia de RNA se muestra en esta vasta animación  producida por la revista Nature.

Visitar la página de la empresa fue un poco frustrante, ya que nada es mencionado en relación a estos compuestos, pero la descripción de la patente contiene informaciones interesantes relacionadas con los tests ya realizados en modelos de cáncer relacionados al FGFR3, en los cuales los compuestos fueron capaces de reducir el crecimiento del cáncer.

Infelizmente, la patente, aunque haya citado siete veces la posibilidad de utilizar este invento como una terapia para la acondroplasia, no muestra cualquier ensayo realizado en un modelo de acondroplasia. Como nada es divulgado, podemos pensar que eso parece más um caso de una terapia en potencial a la espera de ser explorada por un investigador interesado. El mismo caso de los péptidos, armadillas de ligantes y anticuerpos qua analizamos aquí los últimos meses.

El uso de RNA de interferencia contra el FGFR3 es posible y ya fue localizado en algunos trabajos, como en el caso del estudio de los Dres. Guzmán, Pintor e Legeai-Mallet. (3)

La buena noticia es que estamos viendo un número cada vez más grande de opciones terapéuticas tornándose posibles para tests. Eso me hace pensar que, en las palabras de un importante investigador en el campo de la acondroplasia, es probable que en un futuro cercano, el tema no será si habrá una terapia para la acondroplasia, sino cual será la que elegiremos para tratar a nuestros hijos.


Glosario

• Aminoácidos: moléculas con variadas y diferentes propiedades químicas, las cuales son combinadas en secuencias variadas para generar proteínas.

  

• Codón: conjuntos de tres nucleótidos que contienen las informaciones necesarias para identificar el aminoácido correcto durante el armado y montaje de las proteínas. Un cambio de nucleótidos en la posición 1138 del gen FGFR3 conduce a la inserción del aminoácido equivocado en la cadena de la proteína FGFR3 y provoca la acondroplasia.

(de BioGem.Org)

• Condrocitos: las células dentro de los cartílagos de crecimiento, los maestros de crecimiento óseo. En la acondroplasia, debido a la función excesiva del FGFR3 con la mutación G380R, ellos son forzados a reducir sus tasas de multiplicación y de maduración, lo cual a su vez provoca una pérdida significativa del crecimiento del hueso.

•  Exones e intrones: Los exones son las partes de la secuencia del gen que contienen los codones que serán traducidos en los aminoácidos para formar las proteínas. Los intrones son las partes del gen que no poseen codones.

(da Wikipedia)

• Receptor del factor de crecimiento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3): una enzima responsable de controlar la velocidad de la proliferación y la maduración de los condrocitos, que funciona como un freno natural. Cuando funciona en exceso debido a una mutación activadora hace que se reduzca el crecimiento del hueso. Acondroplasia, la causa más común de enanismo, es una consecuencia de una mutación activadora de FGFR3.

• Nucleótidos: son las cuatro moléculas básicas que, combinadas, en secuencias de tres (codones), codificarán las informaciones necesarias para la producción de las proteínas.

(De http://cs.boisestate.edu/~amit/teaching/342/lab/structure.html)

• Transcripción: el proceso a través del cual un gen es leído y un RNA mensajero es creado. Es el primer paso principal para que sea producida una proteína.

• Factores de transcripción: proteínas capaces de identificar ciertas secuencias de nucleótidos no DNA para dar inicio a la lectura del gen.

• Translación: éste es el procedimiento a través del cual una secuencia de nucleótidos presentes en la cadena del mRNA es traducida a una secuencia de aminoácidos, creando una nueva proteína.

• Trechos del DNA antes del punto de inicio del código del gen (upstream sites): ellos significan secuencias de nucleótidos, localizadas antes de la secuencia del gen. Existen por lo menos dos de esas regiones localizadas antes de la secuencia de genes, las promotoras (promoter) y las potencializadoras (enhancers) y ellas son muy importantes para permitir la expresión del gen, como faroles para el complejo de proteínas que irá a leer el gen (ver texto).

Referencias

 1. Gibson G and Asahara H. microRNAs and cartilage. J Orthop Res. 2013 Jun 10. doi: 10.1002/jor.22397. [Epub ahead of print].

2. Oneyama C et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene 2011;30:3489 501.

3. Marina Biotech Patent WO 2011139842 A2. Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof.

4. Guzman-Aránguez A, Legeai‐Mallet L, Pintor J. Fibroblast growth factor receptor 3 inhibition by small interfering RNAs in achondroplasia. Anales Real Acad Nac Farm 2011; 77(1).