FGFR4: a problem for ligand trap therapeutic strategies in achondroplasia?

Introduction

Someone interested in learning about the mechanism of bone growth soon learns that the process through which bones develop is incredibly complex. Most of our bones don’t start as osseous structures but as cartilage templates or scaffolds that, after a very sophisticated series of steps, are substituted by the definitive bone tissue, in a continuous process that last up until the end of puberty, when these cartilage templates disappear. When thinking about bone development, one must have in mind that, although we already have a lot of knowledge about the process, we are still only in the beginning to understand all the biological phenomena that take place within the bones. So, it is not surprising that every other day new pieces of the puzzle are brought by Science, challenging that knowledge, reinforcing the saying by Albert Einstein:

       We still do not know one thousandth of one percent of what nature has revealed to us.
 

I have been thinking about this after reading an interesting study about the effects of fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) on bone growth (1). FGFR4 is a sister of FGFR3, the enzyme that, when mutated, cause achondroplasia. Well, a new piece of the puzzle? I think it is worth to briefly review the study because it might have some implications for some of the new potential therapies for achondroplasia. But, let’s start slowly to put the results of this study in context.

The intricate bone growth process

With some few exceptions, our bones grow starting from small regions located in their extremities, called growth plates (Figure 1). Inside the growth plates live the cells that lead the growth process, the chondrocytes.

Figure 1. Growth plate diagram showing the several chondrocyte layers

The chondrocyte is the “boss” but at the same time has to accomplish many parallel or serial chemical instructions given by dozens of local and systemic growth agents which in turn may work either as growth promoters or suppressors (Figure 2). Chondrocytes, obeying these many local and systemic agents, undergo a series of transformation which can be detected easily in the microscope (Figure 1), beginning from small, dormant cells (resting zone) passing through a phase of high proliferative rate (proliferative zone), to a state in which they have an impressive increase of their cell volume when they are called hypertrophic chondrocytes (Figure 1). This last phase is accounted to be the main responsible stage for bone growth.

Figure 2. Some of the growth factors regulating the growth plate development (2).

Extracted from Kozhemyakina E et al. A pathway to bone: signaling molecules and transcription factors involved in chondrocyte development and maturation. Development 2015;142(5):817-31. Free access. Reproduced here for educational purposes only.

The FGF/FGFR pathway

One of the chemical processes ruling bone growth is provided by what we call the fibroblast growth factor (FGF) / fibroblast growth factor receptor (FGFR) signaling cascade or pathway, which is familiar to whom is interested in achondroplasia. The FGF family is composed by 23 different growth factors, and the FGFR family has four sister enzymes (and one new that is candidate to become the fifth) (3). We are focused in long bone growth here, so I will not mention all the activities the FGF/FGFR axis have in the body and in the few bones that grow by what is called intramembranous process.

To help understanding what is a signaling cascade, you can review other blog related articles (see the English page in the bar above). In short, as in a series of domino blocks a chemical reaction starts another, which activates a third, and that a fourth, in a chain of chemical reactions. These signaling cascades provide instructions to chondrocytes to how they should react to each of the stimuli received. FGFs are called ligands because initiate the chemical cascade by binding (or linking) with the receptor molecule, one of the FGFRs.

Although the number of FGFs is large, only a few have more intense participation in the long bones’ growth process. Scientists have identified so far FGF9 and FGF18 as the most relevant exerting influence over growth plate chondrocytes (3-5).

After decades of their description, researchers have already identified the main functions of the first three FGFRs in bone growth. FGFR4 has not, to date, been recognized as relevant for this process. Take a look in the Table 1, taken from a recent review by Drs. David Ornitz and Nobuyuki Itoh (3), which lists the effect of the ablation of FGFRs in genetic models. You will see that models exploring the ablation (or loss-of-function mutations) of FGFR4 did not show consequences in the growth plate. Rather than that, it seems that FGFR4 is more linked to metabolic processes, including vitamin D and phosphate, which are crucial for bone development/health, but in a redundant fashion with other FGFRs.

Table 1. Consequences of the genetic inhibition (loss of function) of FGFRs

  
FGFR4 relevant for bone growth?

That’s why the recent study by Cinque et al. (1) is interesting. The researchers worked on the role of FGFR4 in bone growth in several cell and animal models and ended to find that blocking FGFR4 signaling causes impairment of bone growth by interfering in a mechanism that is part of the normal cell balance in tissues, called autophagy.

In their study, autophagy was linked to the modulation of collagen 2, which is the main component of the cartilage matrix. I don't want to make it more complex than it already is. Just take that collagen 2 is very important for the expansion of the growth plate and consequently the bone. If you have less collagen 2 in the matrix, the growth process is impaired.

The effect of the inhibition of FGFR4 seems to be especially seen in more mature chondrocytes (pre-hypertrophy/hypertrophy, see above). The absence of FGFR4 signaling would lead to thinner growth plates, thus to smaller bones. Importantly, the researchers found that the FGF with more influence over FGFR4 is FGF18. When FGF18 activates FGFR4, it triggers the chemical reactions inside the chondrocytes that regulate the expression (production) of collagen 2, allowing the normal expansion of the hypertrophic zone. Either the deficiency of FGF18 or the inhibition of FGFR4 lead to disturbance of the autophagy process.

Well, well, this seems odd

These findings are somewhat surprising because, as we saw, previous studies failed to show specific problems caused by the ablation of FGFR4 within the bones. So, how do we deal with this new information? First, we might ask how the researchers in the previous studies assessed the changes caused by the inhibition of FGFR4 in the growth plates. Perhaps they didn't access this specific process in the growth plates at all, or they used different techniques, or the techniques available then were not sensitive enough to spot any relevant consequence of that inhibition. Second, it would be interesting to see if the results obtained by Cinque et al.(1) are reproducible. Sometimes, experiments cannot be reproduced and the original findings are found to be flawed. However, in this case, the investigators seemed to have repeated the tests with different techniques and ended to find basically the same results. Nevertheless, they admit that other studies must be performed to further understand the role of FGFR4 in bone development.
 
And why these findings are a bit worrisome when thinking about treating achondroplasia?  What kind of questions these new data would bring after all?

A problem for ligand trap strategies?

The thing is that we know that FGF18 is one of the relevant activators of FGFR3 in the growth plate. The activation of FGFR3 per se is not a problem in normal conditions: bones need FGFR3 to regulate their growth velocity. However, when FGFR3 is mutated like in achondroplasia, any activation of it contributes to the growth impairment seen in this skeletal dysplasia. One of the approaches being explored to efficiently treat achondroplasia is exactly by blocking FGFR3 activation, and there are several potential strategies aiming this goal. We have been following with great interest the development of the so called ligand trap or ligand decoy strategies (6-8; read this previous article of the blog). Particularly, the study by the group leaded by Dr Gouze (6) showed striking results regarding the rescue of bone growth using a soluble (free) version of FGFR3. Dr. Gouze's group showed so impressive results with their approach in a mouse model (Figure 3) that sFGFR3 is now in serious development aiming potential clinical trials in the future (9).

Figure 3. Effect of the ligand trap sFGFR3 in a mouse model of achondroplasia (6).

  The concept of the ligand trap approach for achondroplasia is quite simple. With a free form of FGFR3 circulating within the growth plate, we would have "competition" between this free version and the cell-anchored FGFR3 (the one that is driving the chondrocyte to stop growing in achondroplasia) for the local FGFs ( mainly FGF9 and 18), resulting in "trapping" of these FGFs by the soluble form and in less activation of the cell-anchored FGFR3s. If these are not activated, they would exert less activity and the bone growth would not be that impaired as we see in achondroplasia. The picture showed above (Figure 3) let us think the ligand trap strategy is promising.

However, these ligand traps will mainly aim FGF9 and FGF18 (and possibly FGF2). Taking in account that FGF18 would be captured by the traps, there would be less activation of FGFR3 (which is what we want, thinking in achondroplasia), but also there could be consequences of having fewer FGF18 activating FGFR4. You see?

FGF18 is thought to be the lead trigger for FGFR3 (3) and, if we take in account the results by Cinque et al. (1), also for FGFR4 signaling. To treat achondroplasia with a ligand trap we could be preventing the action of FGF18 on FGFR3 (which is fine), but also on FGFR4. In the former case, the result would be positive, but in the later, what would be the consequences?

In the study by Cinque et al.(1), the researchers also noted that both FGFR3 and FGFR4 were activated by FGF18 in their models. Both FGFRs were linked to the autophagy process but the researchers noted that only FGFR4 was significantly linked to the control of this phenomenon. Here, again we see some redundancy of the effect of FGFR4 (with FGFR3), so the level of the relevance of the effect of FGFR4 is still to be addressed, and new confirmatory studies are warranted to understand the role of FGFR4 in the growth process.

Meanwhile, with the impressive results demonstrated by the study with sFGFR3 (6; Figure 3), it is possible that any effect of the reduction of FGF18/FGFR4 activation would be surpassed by the growth rescue promoted by the inhibition of the FGFR3 pathway.

We will keep following these developments. The next article will review new information about controlling the production of FGFR3. No, this is no genetic therapy, no DNA editing at all.
 
References

1. Cinque L et al. FGF signalling regulates bone growth through autophagy. Nature 2015; 528:272–5. doi:10.1038/nature16063. 

2. Kozhemyakina E et al. A pathway to bone: signaling molecules and transcription factors involved in chondrocyte development and maturation. Development 2015;142(5):817-31. Free access.

3. Ornitz DM and Itoh N. The Fibroblast Growth Factor signaling pathway. WIRE Dev Biol 2015;4(3):215–66. Free access.

4. Garofalo S et al.Skeletal dysplasia and defective chondrocyte differentiation by targeted overexpression of fibroblast growth factor 9 in transgenic mice. J Bone Miner Res 1999;14(11):1909-15. Free access. 
 
5. Davidson D et al. Fibroblast growth factor (FGF) 18 signals through FGF Receptor 3 to promote chondrogenesis. J Biol Chem 2005;280:20509-15. Free access.

6. Garcia S et al. Postnatal soluble FGFR3 therapy rescues achondroplasia symptoms and restores bone growth in mice. Sci Transl Med 2013;5:203ra124. doi:10.1126/scitranslmed.3006247.

7. Tolcher A et al. Preliminary results of a dose escalation study of the fibroblast growth factor(FGF) “trap” FP-1039 (FGFR1:Fc) in patients with advanced malignancies. 22nd EORTC-NCI-ACR symposium on molecular targets and cancer therapeutics, November 16-19, 2010. Berlin, Germany. Free access.

8. Ghivizzani SC. Delivery of soluble FGFR3 as a treatment for achondroplasia. National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases. 2013; Project Number: 5R01AR057422-04.

9. Therachon press release 2015. Free access.

Tratando la acondroplasia: el papel de los inhibidores de la tirosina-quinasa

Traducción: Maria Cristina Terceros

Introducción

La acondroplasia es causada por una mutación en el gen que codifica (contiene la información química para crear) la proteína llamada receptor del factor de crecimiento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3). El FGFR3 es una proteína que se encuentra anclada a través de la membrana celular de los condrocitos (Figura 1). Posee tres partes o dominios: la parte que se encuentra fuera de la célula y que funciona como una antena, recibiendo señales de los FGFs; el dominio transmembrana, que es "anclado" en la proteína a través de la pared celular; y el dominio intracelular, el cual es el responsable por la propagación de la señal recibida fuera de la célula para otras proteínas dentro de la célula.

Figura 1. Estructura del FGFR3.

 
Las proteínas son moléculas grandes y complejas constituidas por partes más pequeñas que tienen el nombre de aminoácidos. Estos aminoácidos son como piezas de un modelo de Lego: cada uno tiene características diferentes que, combinado con otros, confieren formas y propiedades especiales a la proteína (Figura 2). Por lo tanto, la combinación correcta de aminoácidos es esencial para la función normal de la proteína. (Si usted está curioso y quiere saber más sobre aminoácidos, puede visitar la página Glosario del blog para recabar algunas informaciones o también ir a la Wikipedia)

Figura 2. Combinando piezas de Lego.

La combinación adecuada de aminoácidos en una proteína es crucial para su correcto funcionamiento. En la acondroplasia, una substitución única (la mutación) de uno de estos aminoácidos, deja al FGFR3 más activo de lo que debería. La función normal del FGFR3 es reducir la velocidad de crecimiento del hueso a partir de algunas estructuras estrechas que se localizan en las extremidades de los huesos largos llamadas placas de crecimiento. Debido a la mutación, el FRFR3 trabaja exageradamente y reduce significativamente la capacidad de multiplicación y división de los condrocitos que viven en las placas de crecimiento, lo que lleva a las características clínicas de la acondroplasia.

¿Por qué sucede esto?

Las proteínas que participan en las reacciones químicas en el cuerpo tienen el nombre de enzimas. Las enzimas son bastante activas y el FGFR3 no es diferente. Para controlar las actividades de las enzimas, las células poseen sistemas de “limpieza” que permiten que esas enzimas, cuando están encendidas (o activadas), trabajen solamente por un periodo limitado de tiempo. En la acondroplasia, la mutación hace con que el FGFR3 sea más estable y “resistente” a esos limpiadores, y por eso consigue mantenerse activo por más tiempo.

Bueno, pero eso, ¿qué tiene que ver con el título de este artículo?

Esperemos un poco más. Ya estamos llegando.

Una enzima funciona a través de la transferencia de cargas eléctricas hacia otra proteína (un cliente, que puede ser otra enzima), provocando alteraciones en el cliente. El cliente llevará la carga eléctrica para otro destino, por ejemplo, hacia otra proteína, hacia un determinado lugar en el interior del núcleo de la célula, etc. Va a depender de su(s) función(es). Imaginemos una hilera de dominó, una pieza empujando a la siguiente, etc. Es de esta manera que funcionan las células. Para ayudarle a comprender las reacciones químicas enzimáticas de señalización en cadena o en cascadas, le invito a que vea la película animada que viene a continuación, provista por el Laboratorio Cold Spring Harbor, que publiqué en un artículo anterior del blog (Animación 1).

Animación 1. Esta película animada muestra como el cuerpo va iniciando el proceso de cicatrización después de una contusión en la piel. La parte relevante comienza a los 2:50 minutos, donde se muestra como un ligante (imaginemos un FGF) se une a una enzima receptora en la superficie de una célula (imaginemos el FGFR3) y comienza la cascada de señalización o cascada química. 

DNA Learning Center. Cold Spring Harbor Laboratory

Las enzimas son capaces de transferir esas cargas eléctricas debido a que algunos de los aminoácidos en sus estructuras tienen las propiedades químicas adecuadas para hacerlo. En el caso del FGFR3, existen algunos puntos en la parte que está localizada dentro de la célula ocupada por el aminoácido tirosina (Ver Figura 1). La tirosina se puede unir con algunos cargadores (transportadores) de fósforo reactivo (ATP) que fluctúan en las cercanías dentro de la célula, pero sólo lo hará si es que el FGFR3 es activado (encendido) fuera de la célula. Cuando el FGFR3 es activado (¿vio usted la animación?), a través de variadas y complejas alteraciones en su formato, él expone las tirosinas en su parte intracelular, las cuales a su vez atraen al fósforo en las cercanías, iniciando una serie de reacciones químicas. Usted debería tener en cuenta que aquí estoy simplificando bastante el fenómeno de la “activación”.

 Las regiones donde están localizadas las tirosinas dentro del FGFR3 tienen el nombre de “bolsas” de ATP. Estas bolsas están presentes en otras muchas enzimas con muchas y diferentes funciones en las células, de modo que esas estructuras no son exclusivas del FGFR3. Nosotros también llamamos dominios de tirosina-quinasa (TKD) a esas regiones (Figura 1).

¡Bien, finalmente vemos una conexión con el título!

Desde hace décadas, los científicos conocen estas bolsas de ATP. Ellos descubrieron que, en el cáncer, muchas de las enzimas como el FGFR3 son utilizadas por las células malignas para hacerlas crecer más y más rápidamente. Fue entonces que ellos comenzaron a buscar abordajes que fuesen capaces de bloquear esas bolsas. En teoría, sin las reacciones químicas proporcionadas por enzimas como el FGFR3, muchas células cancerígenas morirían y la enfermedad sería potencialmente controlada.

En realidad, los científicos ya desarrollaron una serie de estrategias para alcanzar ese objetivo. Una de esas estrategias se da exactamente por medio de la creación de moléculas que pueden unirse a los TKD, impidiendo que la enzima inicie las reacciones químicas. Esas moléculas tienen el nombre de inhibidores de tirosina-quinasa (TKI). Ya revisé muchas de ellas con actividad contra el FGFR3 aquí en este blog, pero en la Tabla 1, usted podrá ver una lista más reciente de ellas.

Tabla 1. Algunas nuevas TKIs activas contra los FGFRs. 

Para comprender mejor como es que funcionan esas pequeñas moléculas, le invito a ver esta rica animación que muestra el mecanismo de acción del lapatinib (Animación 2), un TKI desarrollado para bloquear EGFRs, otro tipo de enzimas que trabaja de manera semejante a los FGFRs. Verá que el lapatinib tiene como objetivo las bolsas de ATP en la parte intracelular del EGFR.

Animación 2. Mecanismo de acción del lapatinib (audio en italiano). 

¿Utilizar TKIs en la acondroplasia?

Ya que existen tantas moléculas capaces de bloquear la actividad del FGFR3, ¿por qué no vemos más investigaciones abordando su uso dentro de la acondroplasia? Esos medicamentos podrían ser tomados como comprimidos, una vez al día. ¿No sería perfecto? El problema está, como mencionamos anteriormente, en que las bolsas de ATP (los dominios de la tirosina-quinasa) son bastante parecidas en un gran número de familias de enzimas que trabajan como los FGFRs. ¿Usted se dio cuenta de que no escribí FGFR3 en el título de la Tabla 1? Esto se debe a que ninguno de los compuestos mencionados allí es específico para el FGFR3. Ellos también pueden bloquear la actividad de otros FGFRs y de otras enzimas celulares. Para ilustrar ese recurso del TKIs, puede darle un vistazo al mapa de las familias de enzimas que presentamos a continuación (Figura 3), el cual muestra los grupos de enzimas que algunos TKIs son capaces de bloquear.

Figura 3. Mapa de las enzimas mostrando aquéllas que están afectadas por algunos de los TKIs más viejos. Cada punto de color significa que el TKI tendrá alguna acción sobre aquella enzima. Véase la forma como ha sido dibujado el mapa, como un árbol visto desde arriba.

Ver el gran número de enzimas afectadas por esos TKIs. Imagen de:Stjepanovic N & Capdevila J. Biologics: Targets and Therapy 2014. Aceso libre. Reproducido aquí solamente para fines educativos.

Afectar al mismo tiempo diversas enzimas y sus diferentes funciones, puede representar un problema enorme. Varios efectos indeseados pueden surgir cuando esas drogas son utilizadas para tratamientos contra el cáncer. Sin embargo, algunos de los efectos adversos son tolerables o aceptables debido a la naturaleza de la enfermedad, y también porque, a pesar de afectar varias enzimas al mismo tiempo, los inhibidores de la tirosina-quinasa tienden a ser menos tóxicos que el arsenal de quimioterapia más antiguo, que continúa siendo usado en la actualidad para la lucha contra el cáncer.

De hecho, muchos TKIs, como los anteriormente mencionados, ya están siendo utilizados en la práctica clínica para el tratamiento de varias formas de cáncer, pero solo en adultos. Como su actividad es promiscua podemos prever que los TKI podrían ser peligrosos para el uso en niños, cuyos cuerpos todavía se encuentran en crecimiento. Esas enzimas participan de procesos fundamentales en el desarrollo y bloquearlas en un niño podría causar muchas y malas consecuencias.

Investigadores como el Dr. Moosa Mohammadi, de la New York University, y la Dra Kalina Hristova, de la Johns Hopkins University, han trabajado duro para comprender mejor el grupo de enzimas FGFRs y/o las bolsas de ATP. Ellos crean modelos de las enzimas, computarizados en 3D, e intentan mapear dónde es que se localizan los aminoácidos, para poder prever cómo es que trabajan estas enzimas y así poder ayudar a desarrollar nuevas moléculas para caber en los lugares correctos, aunque esto no sea fácil de hacer. Se puede ver el trabajo del Dr. Mohammadi realizando una sencilla investigación dentro del Pubmed.

Los actuales anti-FGFR no pueden ser utilizados en el tratamiento para la acondroplasia

Tal vez debido a los riesgos previsibles, es improbable que los actuales inhibidores de la tirosina-quinasa puedan ser utilizados en la acondroplasia. Existen evidencias en tests de laboratorio de que ellos funcionan (1), pero, debido a su falta de especificidad, estos TKIs no son candidatos que puedan ser utilizados clínicamente para tratar la acondroplasia.

Para traer más datos sobre el uso de TKIs en la acondroplasia, el grupo liderado por el Dr. Pavel Krejci, un entusiasta investigador en el área del FGFR3, acaba de publicar un convincente estudio en el cual se explora exactamente el uso de algunos de esos TKIs, conocidos por ser más específicos para las enzimas de la familia FGFR en condrocitos y en cultivos de hueso (2). Algunos de los inhibidores de las tirosina-quinasa testeados en su trabajo se encuentran en la lista en la Tabla 1 anteriormente presentada. Después de realizada una serie de tests, tanto en cultivo de células, cultivo de huesos y en modelos animales, el grupo concluyó que sería arriesgado usar para tratamientos de la acondroplasia los TKIs actualmente en desarrollo, precisamente porque ellos bloquean otras enzimas importantes para el desarrollo del organismo en crecimiento.

La exclusividad es difícil de ser alcanzada

Para entender por qué esas moléculas creadas para bloquear las bolsas de ATP afectan varias enzimas, vamos a volver al mapa de las enzimas anteriormente mostrado y conferir su distribución. Usted podrá ver que los manojos (o haces) de las familias de esas enzimas surgen de un tronco principal, como si se tratase de un árbol. Esto significa que aunque existan centenares de enzimas diferentes en la actualidad, todas provienen de pocos antepasados, y por eso mantienen una gran semejanza entre ellas, a lo que los científicos dan el nombre de homología. Los cuatro FGFRs son bastante parecidos, compartiendo más del 50% de su estructura entre los cuatro miembros (3).

Tal y como fue señalado por diferentes investigadores, incluyendo al Dr. Krejci, una molécula exitosa del grupo TKI en el tratamiento de la acondroplasia, tendrá que ser bastante selectiva con el FGFR3, sin ningún efecto en las proteínas hermanas o en las enzimas de otros grupos. Esto aún tomará un buen tiempo para conseguirse, y el éxito se basará, por lo menos en parte, en perfeccionar la capacidad de proyectar modelos de enzimas que sean capaces de disimular su estado natural y su dinámica en la célula viva en la computadora (ordenador).

Esto solamente significa que necesitamos estar abiertos ante las diferentes opciones disponibles para enfrentar enzimas hiperactivas, como el FGFR3 en la acondroplasia. Las bolsas de ATP han sido los objetivos más estudiados debido a que ellas son fáciles de ser alcanzadas. Sin embargo, existen otros lugares en la estructura de la proteína que pueden ser abordados. Le invito a que pueda leer nuevamente los artículos anteriormente publicados en el blog. Descubrirá que hay muchas ideas por ahí, esperando algún científico que las pueda desarrollar, que no esté pensando solamente en los objetivos más fáciles de ser alcanzados.

Referencias


1. Jonquoy A et al. A novel tyrosine kinase inhibitor restores chondrocyte differentiation and promotes bone growth in a gain-of-function Fgfr3 mouse model. Hum Mol Genet 2012;21(4):841-51. Free access.

2. Gudernova I et al. Multikinase activity of fibroblast growth factor receptor (FGFR) inhibitors SU5402, PD173074, AZD1480, AZD4547 and BGJ398 compromises the use of small chemicals targeting FGFR catalytic activity for therapy of short stature syndromes. Hum Mol Genet 2015 Oct 22. pii: ddv441. [Epub ahead of print].

3. Ho HK et al. Current strategies for inhibiting FGFR activities in clinical applications: opportunities, challenges and toxicological considerations. Drug Discov Today 2014 Jan;19(1):51-62.